产品货号：
KL220574
中文名称：
6nt随机引物冻干粉
英文名称：
6 Bases Random Primer
产品规格：
5μg
发货周期：
1～3天
产品价格：
询价
本制品是6碱基、无修饰随机引物的干粉，用于逆转录反应和随机引物标记。
保存：2～8℃，有效期1年。
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| 组分 | 规格 |
| 6nt随机引物冻干粉 | 5μg |
| 说明书 | 1份 |
保存：2～8℃，有效期1年。
- 逆转录反应
- 在6nt随机引物冻干粉管中加入25μL自备的超纯水，涡旋震荡半分钟混匀，得到0.2μg/μL的6碱基随机引物溶液。
- 在一干净的反应管中加入自备的RNA模板。
- RNA模板不能含有基因组DNA污染。
RNA模板种类 加入量 总RNA 100～500ng poly(A) mRNA 10～500ng 专一的RNA 0.01pg～500ng - 加入引物和水：
引物种类 加入量 Oligo (dT)12-18(0.5μg/μL) 1μL 6碱基随机引物(0.2μg/μL) 1μL RNA模板专一性引物 15～20pmol - 随机引物与RNA模板的比例跟cDNA合成的平均长度成反比。
- 加水到13μL。
- 70℃保温5分钟后立即冰浴，此步可以打开RNA的二级结构。
- 再加入5μL 4×RT Buffer(含dNTP)。
- 37℃保温5分钟。对富含二级结构的高GC RNA模板，可以改成45℃保温5分钟。但如果使用随机引物，由于其很短，则改成25℃ 5分钟以便其跟RNA结合。
- 加入1μL MMLV逆转录酶(含RI)，反应终体积为20μL。
- 42℃保温60分钟。但如果使用随机引物，需要先25℃保温10分钟，待合成了一段cDNA后，然后再转移到42℃保温60分钟。此步为RT反应。
- 70℃保温10分钟以终止反应，然后放置在冰上待用。合成的cDNA可以直接作为PCR模板使用，不需要纯化。
- 在6nt随机引物冻干粉管中加入25μL自备的超纯水，涡旋震荡半分钟混匀，得到0.2μg/μL的6碱基随机引物溶液。
- 随机引物标记
- 需要在6nt随机引物冻干粉管中加入12.5μL自备超纯水，涡旋震荡30秒，短暂离心10秒。得到0.4μg/μL的6碱基随机引物溶液，放冰上待用。
- 在一干净的塑料离心管中加入下列成分：
成分 用量 模板DNA
(PCR回收片段，长度100～1000bp)50～150ng 5×随机引物地高辛标记反应液 4μL 6碱基随机引物溶液(0.4μg/μL) 4μL 超纯水 至19μL - PCR仪上100℃加热10分钟使模板DNA彻底变性。
- 立即放冰上待用。不能缓慢降温，否则变性的模板DNA单链又会杂交形成双链。
- 离心数秒使所有液体集中在管底。
- 加入1μL Klenow exo DNA聚合酶，轻柔吹打混匀。此时反应总体积为20μL。
- 37℃保温1～20小时。标记效率跟模板DNA和保温时间相关，模板越多，新合成探针多，但新合成探针/模板比例低，杂交信号低。模板越少，新合成探针少，但探针/模板比例高，杂交信号高。但探针少到一定程度，也不会有杂交反应发生。因此用户需要探针合成量和杂交信号强弱在这两者之间进行折衷选择。
- 反应结束后加热100℃ 5分钟使DNA聚合酶变性，同时使DNA探针变性成单链。变性后的标记反应液可以放-20℃长期保存，也可以直接将变性后的探针加入到杂交反应液中进行杂交。如果电泳检测，标记产物将是弥散状态。
- 需要在6nt随机引物冻干粉管中加入12.5μL自备超纯水，涡旋震荡30秒，短暂离心10秒。得到0.4μg/μL的6碱基随机引物溶液，放冰上待用。
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